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Tipos de microscopios

En el laboratorio de microbiología se dispone de varios tipos de microscopios. Los microscopios tienen diversas aplicaciones y modificaciones que contribuyen a su utilidad.

El microscopio de luz. El microscopio de luz común utilizado en el laboratorio se denomina microscopio compuesto porque contiene dos tipos de lentes que funcionan para magnificar un objeto. El lente más cercano al ojo se llama ocular, mientras que el lente más cercano al objeto se llama objetivo. La mayoría de los microscopios tienen en su base un aparato llamado condensador, que condensa los rayos de luz a un haz fuerte. Un diafragma ubicado en el condensador controla la cantidad de luz que entra a través de él. Tanto los ajustes gruesos como los finos se encuentran en el microscopio de luz (Figura).

Para ampliar un objeto, la luz se proyecta a través de una abertura en el escenario, donde golpea el objeto y luego entra en el objetivo. Se crea una imagen, y esta imagen se convierte en un objeto para la lente ocular, que reimprime la imagen. Así, el aumento total posible con el microscopio es el aumento alcanzado por el objetivo multiplicado por el aumento alcanzado por la lente ocular.

Un microscopio de luz compuesta a menudo contiene cuatro lentes objetivas: la lente de barrido (4X), la lente de baja potencia (10X), la lente de alta potencia (40 X) y la lente de inmersión en aceite (100 X). Con una lente ocular que aumenta 10 veces, el total de aumentos posibles será de 40 X con la lente de escaneo, 100 X con la lente de baja potencia, 400 X con la lente de alta potencia y 1000 X con la lente de inmersión en aceite. La mayoría de los microscopios son parfocales. Este término significa que el microscopio permanece enfocado cuando uno cambia de un objetivo al siguiente.

La capacidad de ver claramente dos objetos como objetos separados bajo el microscopio se denomina resolución del microscopio. La resolución se determina en parte por la longitud de onda de la luz utilizada para observar. La luz visible tiene una longitud de onda de aproximadamente 550 nm, mientras que la luz ultravioleta tiene una longitud de onda de aproximadamente 400 nm o menos. La resolución de un microscopio aumenta a medida que la longitud de onda disminuye, por lo que la luz ultravioleta permite detectar objetos que no se ven con luz visible. El poder de resolución de una lente se refiere al tamaño del objeto más pequeño que se puede ver con esa lente. El poder de resolución se basa en la longitud de onda de la luz utilizada y la apertura numérica de la lente. La apertura numérica (NA) se refiere al cono de luz más ancho que puede entrar en la lente; la NA está grabada en el lado de la lente del objetivo.

Para que el usuario pueda ver los objetos con claridad, debe entrar suficiente luz en la lente del objetivo. Con los microscopios modernos, la entrada al objetivo no es un problema para las lentes de barrido, de baja potencia y de alta potencia. Sin embargo, la lente de inmersión en aceite es excesivamente estrecha y la mayoría de la luz no la ve. Por lo tanto, el objeto se ve mal y sin resolución. Para aumentar la resolución con la lente de inmersión en aceite, se coloca una gota de aceite de inmersión entre la lente y el portaobjetos (figura). El aceite de inmersión tiene la misma capacidad de flexión de luz (índice de refracción) que el portaobjetos de vidrio, por lo que mantiene la luz en línea recta a medida que pasa a través del portaobjetos al aceite y al vidrio del objetivo, la lente de inmersión en aceite. Con el aumento de la cantidad de luz que entra en el objetivo, la resolución del objeto aumenta, y uno puede observar objetos tan pequeños como bacterias. La resolución también es importante en otros tipos de microscopía.

Otros microscopios de luz. Además del conocido microscopio compuesto, los microbiólogos utilizan otros tipos de microscopios para fines específicos. Estos microscopios permiten ver objetos que no se ven de otra manera con el microscopio de luz.

Un microscopio alternativo es el de campo oscuro, que se utiliza para observar espiroquetas vivas, como las que causan sífilis. Este microscopio contiene un condensador especial que dispersa la luz y hace que se refleje en ángulo en la muestra. Un objeto claro se ve sobre un fondo oscuro.

Un segundo microscopio alternativo es el microscopio de contraste de fase. Este microscopio también contiene condensadores especiales que lanzan la luz “fuera de fase” y hacen que pase a través del objeto a diferentes velocidades. Los organismos vivos no manchados se ven claramente con este microscopio, y las partes internas de las células como las mitocondrias, los lisosomas y el cuerpo de Golgi se pueden ver con este instrumento.

El microscopio fluorescente utiliza luz ultravioleta como fuente de luz. Cuando la luz ultravioleta golpea un objeto, excita los electrones del objeto y emite luz en varias tonalidades de color. Como se utiliza luz ultravioleta, la resolución del objeto aumenta. Una técnica de laboratorio llamada técnica de anticuerpos fluorescentes emplea tintes y anticuerpos fluorescentes para ayudar a identificar bacterias desconocidas.

Microscopía electrónica. La fuente de energía utilizada en el microscopio electrónico es un haz de electrones. Dado que el haz tiene una longitud de onda excepcionalmente corta, golpea la mayoría de los objetos a su paso y aumenta significativamente la resolución del microscopio. Con este instrumento se pueden ver virus y algunas moléculas grandes. Los electrones viajan en un vacío para evitar el contacto con moléculas de aire deflectoras, y los imanes enfocan el rayo en el objeto a ser visto. Una imagen se crea en un monitor y es vista por el tecnólogo.

La forma más tradicional de microscopio electrónico es el microscopio electrónico de transmisión (TEM). Para usar este instrumento, uno coloca rebanadas ultrafinas de microorganismos o virus en una rejilla de alambre y luego los tiñe con oro o paladio antes de verlos. Las partes densamente recubiertas del espécimen desvían el haz de electrones, y tanto las áreas oscuras como las claras aparecen en la imagen.

El microscopio electrónico de barrido (SEM) es el microscopio electrónico de forma más contemporánea. Aunque este microscopio da aumentos más bajos que el TEM, el SEM permite vistas tridimensionales de microorganismos y otros objetos. Se utilizan objetos enteros y se tiñen con oro o paladio.

Figura 1
Microscopía de luz. (a) Las partes importantes de un microscopio de luz común. (b) Cómo el aceite de inmersión recoge más luz para su uso en el microscopio.

Para ampliar un objeto, la luz se proyecta a través de una abertura en el escenario, donde golpea el objeto y luego entra en el objetivo. Se crea una imagen, y esta imagen se convierte en un objeto para la lente ocular, que reimprime la imagen. Así, el aumento total posible con el microscopio es el aumento alcanzado por el objetivo multiplicado por el aumento alcanzado por la lente ocular.

Un microscopio de luz compuesta a menudo contiene cuatro lentes objetivas: la lente de barrido (4X), la lente de baja potencia (10X), la lente de alta potencia (40 X) y la lente de inmersión en aceite (100 X). Con una lente ocular que aumenta 10 veces, el total de aumentos posibles será de 40 X con la lente de escaneo, 100 X con la lente de baja potencia, 400 X con la lente de alta potencia y 1000 X con la lente de inmersión en aceite. La mayoría de los microscopios son parfocales, lo que significa que el microscopio permanece enfocado cuando se cambia de un objetivo al siguiente.

La capacidad de ver claramente dos objetos como objetos separados bajo el microscopio se denomina resolución del microscopio. La resolución se determina en parte por la longitud de onda de la luz utilizada para observar. La luz visible tiene una longitud de onda de aproximadamente 550 nm, mientras que la luz ultravioleta tiene una longitud de onda de aproximadamente 400 nm o menos. La resolución de un microscopio aumenta a medida que la longitud de onda disminuye, por lo que la luz ultravioleta permite detectar objetos que no se ven con luz visible. El poder de resolución de una lente se refiere al tamaño del objeto más pequeño que se puede ver con esa lente. El poder de resolución se basa en la longitud de onda de la luz utilizada y la apertura numérica de la lente. La apertura numérica (NA) se refiere al cono de luz más ancho que puede entrar en la lente; la NA está grabada en el lado de la lente del objetivo.

Para que el usuario pueda ver los objetos con claridad, debe entrar suficiente luz en la lente del objetivo. Con los microscopios modernos, la entrada al objetivo no es un problema para las lentes de barrido, de baja potencia y de alta potencia. Sin embargo, la lente de inmersión en aceite es excesivamente estrecha y la mayoría de la luz no la ve. Por lo tanto, el objeto se ve mal y sin resolución. Para aumentar la resolución con la lente de inmersión en aceite, se coloca una gota de aceite de inmersión entre la lente y el portaobjetos (Figura 1). El aceite de inmersión tiene la misma capacidad de flexión de luz (índice de refracción) que el portaobjetos de vidrio, por lo que mantiene la luz en línea recta a medida que pasa a través del portaobjetos al aceite y al vidrio del objetivo, la lente de inmersión en aceite. Con el aumento de la cantidad de luz que entra en el objetivo, la resolución del objeto aumenta, y uno puede observar objetos tan pequeños como bacterias. La resolución también es importante en otros tipos de microscopía.

Otros microscopios de luz. Además del conocido microscopio compuesto, los microbiólogos utilizan otros tipos de microscopios para fines específicos. Estos microscopios permiten ver objetos que no se ven de otra manera con el microscopio de luz.

Un microscopio alternativo es el de campo oscuro, que se utiliza para observar espiroquetas vivas, como las que causan sífilis. Este microscopio contiene un condensador especial que dispersa la luz y hace que se refleje en ángulo en la muestra. Un objeto claro se ve sobre un fondo oscuro.

Un segundo microscopio alternativo es el microscopio de contraste de fase. Este microscopio también contiene condensadores especiales que lanzan la luz “fuera de fase” y hacen que pase a través del objeto a diferentes velocidades. Los organismos vivos no manchados se ven claramente con este microscopio, y las partes internas de las células como las mitocondrias, los lisosomas y el cuerpo de Golgi se pueden ver con este instrumento.

El microscopio fluorescente utiliza luz ultravioleta como fuente de luz. Cuando la luz ultravioleta golpea un objeto, excita los electrones del objeto y emite luz en varias tonalidades de color. Como se utiliza luz ultravioleta, la resolución del objeto aumenta. Una técnica de laboratorio llamada técnica de anticuerpos fluorescentes emplea tintes y anticuerpos fluorescentes para ayudar a identificar bacterias desconocidas.

Microscopía electrónica. La fuente de energía utilizada en el microscopio electrónico es un haz de electrones. Dado que el haz tiene una longitud de onda excepcionalmente corta, golpea la mayoría de los objetos a su paso y aumenta significativamente la resolución del microscopio. Con este instrumento se pueden ver virus y algunas moléculas grandes. Los electrones viajan en un vacío para evitar el contacto con moléculas de aire deflectoras, y los imanes enfocan el rayo en el objeto a ser visto. Una imagen se crea en un monitor y es vista por el tecnólogo.

La forma más tradicional de microscopio electrónico es el microscopio electrónico de transmisión (TEM). Para usar este instrumento, uno coloca rebanadas ultrafinas de microorganismos o virus en una rejilla de alambre y luego los tiñe con oro o paladio antes de verlos. Las partes densamente recubiertas del espécimen desvían el haz de electrones, y tanto las áreas oscuras como las claras aparecen en la imagen.

El microscopio electrónico de barrido (SEM) es el microscopio electrónico de forma más contemporánea. Aunque este microscopio da aumentos más bajos que el TEM, el SEM permite vistas tridimensionales de microorganismos y otros objetos. Se utilizan objetos enteros y se tiñen con oro o paladio.

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